德国医疗系统认证数字PCR样品回收

数字PCR技术流分类目前，dPCR的基本方法都已经建立，根据反应单元的不同形式，主要可分为微板式、微腔式和和微滴式三大类系统。微液滴制备的方法，目前主流的有四种：1）芯片微孔物理分割法，俗称物理分隔法，公司有Fluidgm，Qiagen，Roche，ThermoFisher，;2）液滴分割法，俗称油包水，代替公司有Bio-Rad;3）杂交式芯片液滴法，公司有Stilla;4）注射振动制滴法。PS：芯片式物理分割技术所有已经过期，目前有不少公司在这个技术的基础上进行开发，例如罗氏。数字PCR作为研发阶段的验证方案之一。德国医疗系统认证数字PCR样品回收

20世纪末，Vogelstein等提出数字PCR(digitalPCR，dPCR)的概念，通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元至少包含一个拷贝的目标分子(DNA模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。PCR实际上是一个在模板DNA、引物(模板片段两端的已知序列)和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。华南地区医疗系统认证数字PCR系统杨雁峰博士坚信数字PCR是可以应用于无创产前筛查的理想技术之一，这也是他2016年创立塔歌生物的初衷。

ThermoFisherQuantStudio3D是另一个经典的芯片式数字PCR平台，其基本的检测流程是：将反应液加入到涂布器中，通过涂布器将反应液均匀涂布在有20000个微孔的芯片上，将芯片放在PCR仪上扩增，将芯片放入读取仪中采取拍照的方式读取荧光信号。操作较为复杂，整个过程在封闭的芯片中进行，污染的风险较低。STILLANaica是一个较新的数字PCR平台，基本的检测流程是：将反应液加入芯片，将芯片放入微滴生成扩增系统，生成30,000个微滴单层平铺于芯片中，PCR扩增在芯片上完成。然后将扩增后的芯片转移至微滴阅读分析系统，采取拍照的方式读取荧光信号。由于整个过程在封闭的芯片中进行，污染的风险较低。

作为时下的热点技术，数字PCR是将核酸样品分配到大量单独、平行的微反应单元（nL，纳升级别）中，使得每个反应单元中尽可能含有1个模板分子，并在此基础上进行扩增、检测和分布统计，从而实现靶标分子的比较 计数。（图：数字PCR技术原理）根据微反应单元的不同形式，数字PCR产品可分为微板式、微滴式和芯片式等。目前，市场上主要的数字PCR产品主要是基于微滴式和芯片式，如Bio-Rad公司的QX200微滴式系统和ThermoFisher公司的QuantStudio系统等。与一、二代PCR技术相比，数字PCR具有很多优势：一是特异性、灵敏性均有显著提高；二是在不依赖内参和标准曲线的前提下，可直接得到比较 量化指标；三是微反应单元相互独立、封闭，避免了PCR抑制剂及不同核酸分子扩增产物间的相互干扰，准确度和可重复性较高。数字PCR技术min检测下限可到2copies/ml，比qPCR灵敏度提升了100倍。

对于检测需要高灵敏度以及技术确认的情况下，数字PCR技术也可以发挥重要作用。技术数据表明，数字PCR技术对的比较低检测下限可到2copies/ml，比qPCR灵敏度提升了100倍。经测试，数字PCR在检测和诊断的某些方面优于金标准qPCR，尤其是在低病毒载量样本中，相比起qPCR，数字PCR特异性、灵敏度、重现性和检测限受影响更小。因此，未来预计数字PCR技术也将在类疾病中得到更加广的应用。数字PCR的应用甚广，除了可应用于进行突变的检测以外，也可运用于基因扩增的检测。通过数字PCR技术可建立多重荧光体系，用于同时检测比如非小细胞肺中常见的MET和HER2耐药扩增。有研究报道，使用数字PCR技术对436例非小细胞肺样品进行检测，并挑选样本验证了数字PCR与RNA fish的检测一致性。结果表明，该数字PCR技术在保证了基因扩增检测准确性的同时，还节约了检测时间。检测结果部分为阳性，部分为阴性，之后进行分子数统计，不需做标曲。深圳双螺旋生物仪器数字PCR荧光通道

数字PCR在检测珍贵样品和样品核酸存在降解时具有明显的优势。德国医疗系统认证数字PCR样品回收

常规PCR和实时荧光PCR定量检测都需要已知拷贝数的标准DNA制定标准曲线，由于样品测定在各种条件上不会完全一致，会造成PCR扩增效率的差异，从而影响定量结果的准确性。而ddPCR不受标准曲线和扩增动力学影响，可以进行定量。如何在双通道设置及双探针标记的情况下实现多重检测?不同位点的双探针检测体系中引物和探针采用不同的终浓度，这样阳性微滴的终点FAM/HEX荧光信号强度就会不同，利用阳性微滴不同的“分簇(cluster)”来区分不同的突变位点。采用对应的KRAS野生型和突变型细胞系对双重ddPCR检测体系的性能进行验证。结果显示除了Q61H位点外，其他位点的检测体系在54C的情况下均能很好的区分4个明显的cluster。德国医疗系统认证数字PCR样品回收

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