法国一体化数字PCR原理

dPCR在使用过程中需要特别注意体积误差造成的结果偏差。体积误差对于测量拷贝数浓度会产生偏差。目前dPCR中体积优化方法以光学显微镜观测为主。分散体积的差异会增加拷贝数结果的不确定性，Emslie等使用光学显微镜纵向拍照比较图片边缘的微小差异，考察了数字PCR系统中每个微孔内和孔与孔间的体积差异对实验结果的影响程度。Corbisier等使用微滴数字PCR对6种不同质量分数棉籽粉质粒DNA标准物质[ERM-AD623a-f，浓度范围（10~10）copies/ul]进行分析，优化了液滴体积得到相应校正因子，并使用该校正因子发现并校准了运行软件中液滴体积不变的假设而引起的数据偏离，数据结果的一致性有明显提高。数字PCR的应用甚广，除了可应用于进行突变的检测以外，也可运用于基因扩增的检测。法国一体化数字PCR原理

数字PCR是一种核酸分子定量技术。当前核酸分子的定量有三种方法，光度法基于核酸分子的吸光度来定量；实时荧光定量PCR（RealTimePCR）基于Ct值，Ct值就是指可以检测到荧光值对应的循环数；数字PCR是的定量技术，基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。广州全自动数字PCR生命科学用品模板 DNA 量越多，荧光达到域值的循环数越少，即 Ct 值越小。

PCR常使用目标序列的拷贝数或某一给定样品中转基因的百分比来体现方法灵敏度。由于qPCR和dPCR实验过程所用试剂的兼容性较好，在使用dPCR进行转基因检测时，通常直接参照qPCR的方法。使用不同技术对相同样品检测时，两种方法的灵敏度是否具有可比性成为关注的问题。Burns等21]使用Fluidigm公司的12.765（12板，每板765个微单元）芯片数字PCR分析仪测定标准物质ERM-AD413检测转基因玉米MON810。该小组应用dPCR技术评估在qPCR定义下的灵敏度数值，在拷贝数200-700之间，dPCR与qPCR的测量结果具有一致性。但与qPCR的灵敏度相比，dPCR在低于拷贝数200时有被低估的风险，在高于拷贝数1000时有被高估的风险。dPCR在同一阵列上同时测量转基因和内源性靶点时，需要稀释内源性靶点和转基因靶点在合理拷贝数范围内以保证dPCR测量结果的准确性。

基于微滴的QX100dPCR仪，利用油包水技术，将样品平均分配到20000个微滴油包水中，利用微滴分析仪对微滴进行分析。2012年RainDance公司推出了RainDropdPCR仪，在高压气体驱动下，将每个标准反应体系分割成包含100万至1000万个皮升级别微滴的反应乳液。数字PCR就形成了2大派别，芯片式和微滴式。不论是哪种数字PCR，其原理都是有限稀释，终点PCR和泊松分布。将含有核酸模板的标准PCR反应体系，平均分配成几万个PCR反应，分配到芯片或微滴中，使每个反应中尽可能含有一个模板分子，进行单分子模板PCR反应，通过读取荧光信号的有或无进行计数，经过统计学泊松分布的校准进行定量。通过不同cluster的位置进行突变位点的判断时存在误判的现象。

微滴数字PCR主要是将两种互不相溶的液体，以其中一种作为连续相（油），另一种作为分散相（水），在水/油两相表面张力和剪切共同作用下分散相以微小体积单元的形式存在于连续中，从而成液滴。这种液滴式的反应腔室具有体积小、样品间无扩散等优势。在ddPCR中，利用微滴发生器可以一次生成数万乃至百万个纳升甚至皮升级别的单个油包水微滴，作为数字PCR的样品分散载体。这里，液滴中包裹了单拷贝DNA模板和PCR反应液，然后将液滴收集在PCR反应管中进行扩增。PCR反应结束后检测每个微滴的荧光信号。目前Bio-Rad公司的QX100系统、QX200系统均为采用液滴技术的数字PCR系统。图6.Bio-Rad的液滴数字PCR系统3D数字PCR是基于纳米流体芯片进行检测，通过一次检测，将样品分到数千个单独的PCR。深圳微滴式数字PCR仪器

相较于qPCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的定量。法国一体化数字PCR原理

相比于qPCR，dPCR在转基因检测中具有以下优势：（1）检测灵敏度高：理论上dPCR的灵敏度可达1个拷贝，而实际应用中dPCR的小检出限和比较低定量限数值非常接近，所以dPCR可以在非常低的目标拷贝数下得到精确的结果；通常转基因比参考基因（内源基因）浓度低很多；（2）前处理简单且受基质成分干扰较小：dPCR反应效率和精密度受到食品基质成分干扰影响较小，可应用于混合基质样品中低丰度DNA的检测；（3）dPCR对抑制剂的敏感性较低：由于dPCR结果表示为“有荧光“或“无荧光”，即使存在抑制剂降低了荧光强度仍可以表示为“有荧光；（4）适合多重转基因检测：食品或饲料提取的DNA中可能包含多种转基因片段，可以进行多重dPCR检测，提高分析效率。同时，dPCR可以直接溯源至SI国际单位制摩尔，适合单一、双重及多重转基因标准物质研究，一次可识别不同的转基因区域。下面详细进行说明。法国一体化数字PCR原理

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