锐讯数字PCR油滴制造
数字PCR系统的分散方式决定了分散数量,其结果基于统计的方法进行定量,增加反应单元数量(统计样本量),可以增加其检测的容量和动态检测线性范围达到和qPCR相近的动态范围,同时减小一个反应单元中包含多个分子所造成的误差,达到提高灵敏度和准确度。影响dPCR定量结果的因素包括:仪器采用的分散方式与数量、溶液稀释方法、分散体积的准确性以及结果表达方式。分散方式与数量由数字PCR系统决定,分散体积和结果表达方式需要实验人员在实验过程中优化得到。数字PCR作为研发阶段的验证方案之一。锐讯数字PCR油滴制造
数字PCR系统通过其独特的微流体阵列式芯片板(MAP)技术,提供强大而易于使用的数字PCR体验。这种专有技术可实现对样品进行一致的自动腔室化,可将一份样品腔室化至20,000个微反应室,其变异系数(CV)达到比较好的<1%。与其它数字PCR系统不同,MAP技术不使用乳液或其它基于液滴的方法对反应进行腔室化。而是利用分配通道将试剂递送至微反应室,具有高精密度和一致性。此外,QuantStudioAbsoluteQ系统可分析加载样品的95%以上,确保获得高度准确的数字PCR结果。臻准数字PCR荧光通道通过“仪器+试剂”相互配合的方式,打出了数字PCR检测的“组合拳”。
数字PCR技术流分类目前,dPCR的基本方法都已经建立,根据反应单元的不同形式,主要可分为微板式、微腔式和和微滴式三大类系统。微液滴制备的方法,目前主流的有四种:1)芯片微孔物理分割法,俗称物理分隔法,公司有Fluidgm,Qiagen,Roche,ThermoFisher,;2)液滴分割法,俗称油包水,代替公司有Bio-Rad;3)杂交式芯片液滴法,公司有Stilla;4)注射振动制滴法。PS:芯片式物理分割技术所有已经过期,目前有不少公司在这个技术的基础上进行开发,例如罗氏。
由于现有的商业化数字PCR设备在物理上只设置了2个检测通道,所以存在一个明显的短板:不能同时进行多个位点的检测。在样品多位点的检测中,就需要更多的起始样品,但临床上组织的样品非常有限。相比之下荧光定量PCR仪上就很容易实现多重检测。为了考察利用数字PCR实现多重检测的可能性,英国TheInstituteofCancerResearch的研究人员以非小细胞肺相关的KRAS基因为检测对象,在Bio-Rad的数字PCR系统上通过3个三重ddPCR检测体系来实现9个KRAS突变位点的检测。模板 DNA 量越多,荧光达到域值的循环数越少,即 Ct 值越小。
作为时下的热点技术,数字PCR是将核酸样品分配到大量单独、平行的微反应单元(nL,纳升级别)中,使得每个反应单元中尽可能含有1个模板分子,并在此基础上进行扩增、检测和分布统计,从而实现靶标分子的比较 计数。(图:数字PCR技术原理)根据微反应单元的不同形式,数字PCR产品可分为微板式、微滴式和芯片式等。目前,市场上主要的数字PCR产品主要是基于微滴式和芯片式,如Bio-Rad公司的QX200微滴式系统和ThermoFisher公司的QuantStudio系统等。与一、二代PCR技术相比,数字PCR具有很多优势:一是特异性、灵敏性均有显著提高;二是在不依赖内参和标准曲线的前提下,可直接得到比较 量化指标;三是微反应单元相互独立、封闭,避免了PCR抑制剂及不同核酸分子扩增产物间的相互干扰,准确度和可重复性较高。三重ddPCR检测体系存在的问题:不同位点检测体系之间的cross-reactivity。微滴式数字PCR价格
拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。锐讯数字PCR油滴制造
相比于qPCR,dPCR在转基因检测中具有以下优势:(1)检测灵敏度高:理论上dPCR的灵敏度可达1个拷贝,而实际应用中dPCR的小检出限和比较低定量限数值非常接近,所以dPCR可以在非常低的目标拷贝数下得到精确的结果;通常转基因比参考基因(内源基因)浓度低很多;(2)前处理简单且受基质成分干扰较小:dPCR反应效率和精密度受到食品基质成分干扰影响较小,可应用于混合基质样品中低丰度DNA的检测;(3)dPCR对抑制剂的敏感性较低:由于dPCR结果表示为“有荧光“或“无荧光”,即使存在抑制剂降低了荧光强度仍可以表示为“有荧光;(4)适合多重转基因检测:食品或饲料提取的DNA中可能包含多种转基因片段,可以进行多重dPCR检测,提高分析效率。同时,dPCR可以直接溯源至SI国际单位制摩尔,适合单一、双重及多重转基因标准物质研究,一次可识别不同的转基因区域。下面详细进行说明。锐讯数字PCR油滴制造
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